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酶免疫分析——技術(shù)進步與自動化

更新時間:2021-10-12   點擊次數(shù):1017次

酶免疫分析(Enzyme Immunoassay,EIA)是標記免疫分析中的一項重要技術(shù),是以酶標記的抗體(抗原)作為主要試劑,將抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶催化底物反應(yīng)的高效性和專一性結(jié)合起來的一種免疫檢測技術(shù)。作為經(jīng)典的三大標記技術(shù)之一,酶免疫技術(shù)在檢驗醫(yī)學中得到廣泛應(yīng)用并不斷得到更新,不斷和其他先進技術(shù)如熒光、發(fā)光技術(shù)以及儀器自動化相融合,日臻完善,許多自動化儀器實際上是EIA技術(shù)和其他現(xiàn)代化技術(shù)的復合體,其分析敏感度已達到甚至大大超過放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)的水平,因試劑穩(wěn)定無放射性污染且分析形式日趨多樣化,簡易靈活,臨床應(yīng)用廣泛而倍受重視。


一、酶免疫分析的技術(shù)進步


近年來,EIA技術(shù)取得了顯著的發(fā)展,主要表現(xiàn)在以下方面:


1、 繼單克隆抗體后的第三代抗體基因工程抗體的應(yīng)用,明顯地提高了檢測的特異性,基本消除了抗原、抗體間的非特異性交叉反應(yīng),保證了分析的準確性??贵w制備技術(shù)的進步,使試劑的生產(chǎn)制備得以規(guī)模化,檢測范圍日益擴展,小分子抗原、半抗原的檢測成為事實。


2、 分析方式的改進與多樣化提高了試驗的敏感性。


(1) 除早期的競爭法,間接法外,又發(fā)展了雙抗原夾心法測抗體,偶聯(lián)酶標記法測抗原,橋聯(lián)酶免疫分析,酶放大免疫分析技術(shù)等,后者應(yīng)用了生物素-親和素系統(tǒng),底物循環(huán)放大系統(tǒng),酶-抗酶放大系統(tǒng)及酶偶聯(lián)放大系統(tǒng)等。


(2)由于酶標記技術(shù)的進步,標記酶的應(yīng)用已從過氧化物酶,擴展到堿性磷酸酶,β半乳糖苷酶,尿素酶,葡萄糖6磷酸脫氫酶,葡萄糖氧化酶,蘋果酸脫氫酶,至今有二十多種酶被應(yīng)用于EIA ,但應(yīng)用最多的仍然是辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)和堿性磷酸酶(Alkalinephasphotase,ALP)。


(3) 酶免疫分析與其它標記免疫分析相結(jié)合如與熒光免疫分析(Fluorescence Immunoassay ,FIA)結(jié)合形成熒光酶免疫分析(Fluorescence Enzyme Immunoassay ,F(xiàn)EIA),酶促放大時間分辨熒光免疫分析(Enzyme-am-plified time-resolved fluoroimmunoassay ,EATRFIA),EIA與化學發(fā)光免疫分析(Chemiluminescence immunoassay,CLIA)結(jié)合形成酶—化學發(fā)光免疫分析,增強化學發(fā)光酶免疫分析(ECLEIA)。EIA與聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合形成的PCR-EIA分析等。


(4)改進固相載體的技術(shù)


傳統(tǒng)ELISA應(yīng)用的固相載體是聚苯乙稀微孔板,聚苯乙烯珠或條,后發(fā)展為硝酸纖維素膜、活化濾紙、硅片、尼龍、利用高分子材料合成的各種固相微粒等。為提高固相表面的結(jié)合容量,增加結(jié)合物的范圍而改造聚苯乙烯的表面,如用化學偶聯(lián)法導入功能性醛基、酰基、烷胺基等以更好地與蛋白質(zhì),多肽的羧基結(jié)合,用位點導向性共價偶聯(lián)法引入親和素,蛋白A,多聚賴氨酸等,以牢固地捕獲蛋白或多肽,超平整聚苯乙烯表面的制備,克服了表面粗糙帶來的不均一性,達到平均粗糙度只有2A+的超平整平面,實現(xiàn)了對蛋白的結(jié)合容量大,脫附率低,孔間均一性好,使試驗精密度達5%。


應(yīng)用于雙抗體夾心法時,聚苯乙烯經(jīng)射線照射后,可以增加其吸附性能特別是對免疫球蛋白的吸附性能。近年美國Corning公司研制成功表面經(jīng)琥珀酰亞胺酯活化酶標板,其質(zhì)量達到氨基活化相似水平。


(5)分析方法的創(chuàng)新 如同步ELISA法測定多種抗體是將抗原包被在與微孔相匹配的釘板的釘子上,蓋上釘板的同時與微孔內(nèi)的所需標本、試劑反應(yīng),是又一種改良ELISA。利用抗體和抗抗體能形成多層復合物的特性,將常規(guī)二步溫育法改為一步溫育測定法,使檢測時間大為縮短,現(xiàn)在已廣為應(yīng)用。



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